E-2010-实验动物饮用水微生物质量检测标准操作规程：修订间差异

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'''实验动物饮用水微生物质量检测标准操作规程'''
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==一、目的==


''一、目的''
为保障动物福利，避免饮水污染带来的动物健康问题，定期对动物饮用水的微生物质量进行检测，符合《GB 14925-2023 实验动物 环境及设施》中 8.3 内容的规定，特制定此标准操作规程<ref name=GB14925>GB 14925-2023 实验动物 环境及设施，发布日期2023-11-27，实施日期2024-06-01</ref>。


为保障动物福利，避免饮水污染带来的动物健康问题，定期对动物饮用水的微生物质量进行检测，特制定此标准操作规程。
==二、适用范围==


''二、适用范围''
实验动物中心动物饮用水，包括自动饮水、反渗透水、高压灭菌水、酸化水。


实验动物中心动物饮用水，包括自动饮水、反渗透水、高压灭菌水、酸化水。
关于动物饮用水，可以参考[[饲养体系#1.5 饮水]]部分内容。
 
==三、检测试剂及材料==
GB/T 14926.41-2001 实验动物 无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法中使用是BHI，FTM，SOYA三种培养基。
 
=== BHI ===
脑心浸出液肉汤（BHI）培养基：英文名称是Brain Heart Infusion Broth非选择性培养基，细菌、霉菌和酵母菌均能生长良好；用于培养各种苛养型致病微生物<ref name=GB/T14926.41-2001>GB/T 14926.41-2001 实验动物 无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法，P69</ref>。
 
=== FTM ===
硫乙醇酸盐流体（FTM）培养基：英文名称是Fluid Thiolglycollate Medium。硫乙醇酸盐流体培养基主要用于培养需氧、厌氧和微需氧微生物，是培养厌氧菌的首选培养基。该培养基在药典中一直被用作无菌检查培养基，具有重要的作用<ref name=GB/T14926.41-2001></ref>。


''三、检测试剂及材料''
=== SOYA ===
胰酪大豆胨琼脂培养基(大豆酪蛋白琼脂培养基，SOYA)：常说的SOYA培养基，英文名称是Soybean Casein Digest Agar (Casein Soya Bean Digest Agar ) <ref name=GB/T14926.41-2001></ref>。


R2A琼脂培养基、量筒、锥形瓶、无菌平皿（90mm*15mm）、三角涂布棒、酒精灯、移液管（10ml）、移液器（1000ul、200ul）、离心管（15ml、1.5ml）。
=== Columbia血平皿 ===
哥伦比亚血琼脂培养基（Columbia Blood Agar）：用于培养苛养和非苛养型微生物<ref>Chriss J. Vowles • Natalie E. Anderson
Kathryn A. Eaton，Gnotobiotic mouse Technology，CRC press</ref>。


''四、检测频率''
=== SDA ===
沙保氏培养基：英文名字是Sabouraud Dextrose Agar（SDA），是通用型的真菌培养基。


每月检测一次。
=== M17===
M17培养基：分离乳酸链球菌的标准培养基，用于检测、分离和计数乳酸菌（乳酸链球菌、乳酸乳球 菌、乳酸杆菌），还用于检测链球菌的非乳糖发酵型突变株。。乳酸链球菌在营养上为苛养型，需要复杂的培养基才能达到最佳生长<ref>Anderson A. W. and Elliker P. R. (1953) J. Dairy Science 36.161-167.</ref><ref>Reiter B. and Oram J. D. (1962) J. Dairy Res.29.63-77.</ref>。


检测不符合要求时，立即停止使用整改，待检测合格后再启用。
=== R2A ===
R2A琼脂培养基：微生物限度检查。


''五、检测方法''
注：中国药典（2020版）注射用水微生物限度检查：<br>
取注射用水不少于100ml，经薄膜过滤法处理，采用R2A琼脂培养基，30-35℃培养不少于5天。100 ml供试品中需氧菌总数不得超过10cfu。


1. 称取R2A琼脂培养基固体粉末18.12g于锥形瓶中，加入1000ml纯化水，加热溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，倒入无菌培养皿，4℃冰箱备用。
==四、检测频率==
=== 自检 ===
水的质量与动物质量息息相关，建议不低于每月检测一次。


2. 取样前，用酒精对水管口、水瓶口及周边空间进行彻底消毒。
检测不符合要求时，立即停止使用，联系设施维保部分消毒，待检测合格后再启用。


3. 采集自动饮水和反渗透水时，先打开排水开关，放水1分钟后采集10ml待测水样于灭菌后的15ml离心管内；采集瓶装高压灭菌水及酸化水时，使用移液管取10ml待测水样于灭菌后的15ml离心管内；同时采集10ml已知污染水（如洗刷脏笼盒水）于灭菌后的15ml离心管内作为阳性对照。
每次更换滤芯或维修后，建议检测一次，合格后使用。


4. 将水样放于离心机内离心（4000r/min 10min），富集可能存在的微生物。
=== 送检 ===
建议每年送第三方检测机构进行不少于一次的水质检测。


5. 将水样转移至生物安全柜内，使用移液器从离心管底部取1ml的富集液转移至灭菌后的1.5m离心管内。
==五、检测方法==


6. 将3只三角涂布棒在75%酒精中浸泡一下，再放于酒精灯上灼烧消毒灭菌，晾凉备用。
=== 自动饮水系统水样取样、检测 ===
# 对使用中的自动饮水装置每段水路的末端排水口进行取样，新增加的笼架增加哨兵鼠位置采样。
# 排水口位于IVC笼架的侧面，上有可手动调节的旋钮开关。取样前，用酒精对排水管口及周边空间进行彻底消毒。
# 在管口下放置容器用以承接废水，打开排水开关，放水1分钟后接取中段水。可使用一次性无菌 15 ml离心管接取待测水样，过程中，避免手碰到管口，接完水立即盖上管盖。
# 将待测水样转移至生物安全柜中进行后续检测实验。分装少量待测水样于1.5 ml EP管中，转速5000 rpm离心8 min。
# 将离心管中的液体轻轻到处，再从15 ml离心管中取200 μl转移到刚离心过的1.5 ml EP中重悬底部沉降物质，使用移液枪从EP管底部分别吸取100 μl水样接种到哥伦比亚血琼脂培养基和沙保氏培养基，用三角涂布棒将水样涂抹均匀。
# 将接种完成的哥伦比亚血琼脂培养基放置于37 °C培养箱培养；沙保氏培养基放置于28 °C培养箱培养，48 h后，观察两种培养基表面是否有菌落生长。
# 检测为阳性的房间饮水，应分析阳性原因，整改后需要重新采样再次重复上述操作进行检测，直至检测为阴性为止。


7. 取200ul富集液加入到已铺好的R2A琼脂培养基平皿上，用三角涂布棒将富集液在平皿上涂抹均匀，平皿底部标注样品编号、日期、操作人员等。
=== RO饮用水取样 ===
# 取样前，用酒精对水管口、水瓶口及周边空间进行彻底消毒。
#采集自动饮水和反渗透水时，先打开排水开关，放水1分钟后采集10ml待测水样于灭菌后的15ml离心管内；采集瓶装高压灭菌水及酸化水时，使用移液管取10ml待测水样于灭菌后的15ml离心管内；同时采集10ml已知污染水（如洗刷脏笼盒水）于灭菌后的15ml离心管内作为阳性对照。
# 将水样放于离心机内离心（4000r/min，10min），富集可能存在的微生物。
# 将水样转移至生物安全柜内，使用移液器从离心管底部取1ml的富集液转移至灭菌后的1.5m离心管内。
# 将3只三角涂布棒在75%酒精中浸泡一下，再放于酒精灯上灼烧消毒灭菌，晾凉备用。
# 取200ul富集液加入到已铺好的R2A琼脂培养基平皿上，用三角涂布棒将富集液在平皿上涂抹均匀，平皿底部标注样品编号、日期、操作人员等。
# 将平皿倒置放于32℃培养箱内，培养72小时，观察是否有菌落生长。
# 另取同一批配置的空白平皿同样条件下进行培养，作为阴性对照。
# 检测为阳性的房间饮水，应分析阳性原因，整改后需要重新采样再次重复上述操作进行检测，直至检测为阴性为止。


8. 将平皿倒置放于32℃培养箱内，培养72小时，观察是否有菌落生长。
==六、结果判定==


9. 另取同一批配置的空白平皿同样条件下进行培养，作为阴性对照。
# 脑心浸液培养基和硫乙醇酸钠培养基置（36±1）℃培养至少14d，并在培养第7d和第14d涂片、革兰染色镜检<ref name=GB/T14926.41-2001></ref>；
# 血琼脂平皿置（36±1）℃培养48h，观察有无细菌生长<ref name=GB/T14926.41-2001></ref>；
# 大豆蛋白胨肉汤培养基置25~28℃培养至少14d，观察有无真菌生长<ref name=GB/T14926.41-2001></ref>。
其他培养基需要在查找文献，一般置37℃培养至少48h，无菌斑形成才认为合格。


''六、结果判定''
== 七、检测的局限性 ==
*培养只涉及了细菌项目，不监测寄生虫和病毒。
*细菌项目仅限需氧菌，不涉及厌氧菌。
*细菌项目仅限在R2A琼脂培养基上可以生长的。严格意义上，至少需要SOYA、BHI、M17等多种培养基上无菌才更全面。


1. 若培养72h后，平皿中有肉眼可见的菌落生长则为阳性
== 八、 讨论 ==
ATP Bioluminescence Test仪器也可以用于无菌检测 ，但是需要建立自己的方法
<ref>Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition，P73</ref>。


2. 若培养72h后，平皿中无肉眼可见的菌落生长则为阴性
==  九. 参考文献==
<references />


3. 以上两种结果只有在空白平皿无菌落生长，阳性平皿有菌落生长时检测结果才算有效。
== 十. 版权说明 ==
[[文件:实验动物饮用水微生物质量检测 图片1.png|缩略图|R2A培养基检测动物饮用水菌落总数]]
此文章由中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心吕安老师编制，常在修改后发表。
适用于[[LabAnimalWiki:隐私政策]]。

2024年9月22日 (日) 21:31的最新版本

一、目的

为保障动物福利，避免饮水污染带来的动物健康问题，定期对动物饮用水的微生物质量进行检测，符合《GB 14925-2023 实验动物 环境及设施》中 8.3 内容的规定，特制定此标准操作规程[1]。

二、适用范围

实验动物中心动物饮用水，包括自动饮水、反渗透水、高压灭菌水、酸化水。

关于动物饮用水，可以参考饲养体系#1.5 饮水部分内容。

三、检测试剂及材料

GB/T 14926.41-2001 实验动物 无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法中使用是BHI，FTM，SOYA三种培养基。

BHI

脑心浸出液肉汤（BHI）培养基：英文名称是Brain Heart Infusion Broth非选择性培养基，细菌、霉菌和酵母菌均能生长良好；用于培养各种苛养型致病微生物[2]。

FTM

硫乙醇酸盐流体（FTM）培养基：英文名称是Fluid Thiolglycollate Medium。硫乙醇酸盐流体培养基主要用于培养需氧、厌氧和微需氧微生物，是培养厌氧菌的首选培养基。该培养基在药典中一直被用作无菌检查培养基，具有重要的作用[2]。

SOYA

胰酪大豆胨琼脂培养基(大豆酪蛋白琼脂培养基，SOYA)：常说的SOYA培养基，英文名称是Soybean Casein Digest Agar (Casein Soya Bean Digest Agar ) [2]。

Columbia血平皿

哥伦比亚血琼脂培养基（Columbia Blood Agar）：用于培养苛养和非苛养型微生物[3]。

SDA

沙保氏培养基：英文名字是Sabouraud Dextrose Agar（SDA），是通用型的真菌培养基。

M17

M17培养基：分离乳酸链球菌的标准培养基，用于检测、分离和计数乳酸菌（乳酸链球菌、乳酸乳球 菌、乳酸杆菌），还用于检测链球菌的非乳糖发酵型突变株。。乳酸链球菌在营养上为苛养型，需要复杂的培养基才能达到最佳生长[4][5]。

R2A

R2A琼脂培养基：微生物限度检查。

注：中国药典（2020版）注射用水微生物限度检查：
取注射用水不少于100ml，经薄膜过滤法处理，采用R2A琼脂培养基，30-35℃培养不少于5天。100 ml供试品中需氧菌总数不得超过10cfu。

四、检测频率

自检

水的质量与动物质量息息相关，建议不低于每月检测一次。

检测不符合要求时，立即停止使用，联系设施维保部分消毒，待检测合格后再启用。

每次更换滤芯或维修后，建议检测一次，合格后使用。

送检

建议每年送第三方检测机构进行不少于一次的水质检测。

五、检测方法

自动饮水系统水样取样、检测

  1. 对使用中的自动饮水装置每段水路的末端排水口进行取样，新增加的笼架增加哨兵鼠位置采样。
  2. 排水口位于IVC笼架的侧面，上有可手动调节的旋钮开关。取样前，用酒精对排水管口及周边空间进行彻底消毒。
  3. 在管口下放置容器用以承接废水，打开排水开关，放水1分钟后接取中段水。可使用一次性无菌 15 ml离心管接取待测水样，过程中，避免手碰到管口，接完水立即盖上管盖。
  4. 将待测水样转移至生物安全柜中进行后续检测实验。分装少量待测水样于1.5 ml EP管中，转速5000 rpm离心8 min。
  5. 将离心管中的液体轻轻到处，再从15 ml离心管中取200 μl转移到刚离心过的1.5 ml EP中重悬底部沉降物质，使用移液枪从EP管底部分别吸取100 μl水样接种到哥伦比亚血琼脂培养基和沙保氏培养基，用三角涂布棒将水样涂抹均匀。
  6. 将接种完成的哥伦比亚血琼脂培养基放置于37 °C培养箱培养；沙保氏培养基放置于28 °C培养箱培养，48 h后，观察两种培养基表面是否有菌落生长。
  7. 检测为阳性的房间饮水，应分析阳性原因，整改后需要重新采样再次重复上述操作进行检测，直至检测为阴性为止。

RO饮用水取样

  1. 取样前，用酒精对水管口、水瓶口及周边空间进行彻底消毒。
  2. 采集自动饮水和反渗透水时，先打开排水开关，放水1分钟后采集10ml待测水样于灭菌后的15ml离心管内；采集瓶装高压灭菌水及酸化水时，使用移液管取10ml待测水样于灭菌后的15ml离心管内；同时采集10ml已知污染水（如洗刷脏笼盒水）于灭菌后的15ml离心管内作为阳性对照。
  3. 将水样放于离心机内离心（4000r/min，10min），富集可能存在的微生物。
  4. 将水样转移至生物安全柜内，使用移液器从离心管底部取1ml的富集液转移至灭菌后的1.5m离心管内。
  5. 将3只三角涂布棒在75%酒精中浸泡一下，再放于酒精灯上灼烧消毒灭菌，晾凉备用。
  6. 取200ul富集液加入到已铺好的R2A琼脂培养基平皿上，用三角涂布棒将富集液在平皿上涂抹均匀，平皿底部标注样品编号、日期、操作人员等。
  7. 将平皿倒置放于32℃培养箱内，培养72小时，观察是否有菌落生长。
  8. 另取同一批配置的空白平皿同样条件下进行培养，作为阴性对照。
  9. 检测为阳性的房间饮水，应分析阳性原因，整改后需要重新采样再次重复上述操作进行检测，直至检测为阴性为止。

六、结果判定

  1. 脑心浸液培养基和硫乙醇酸钠培养基置（36±1）℃培养至少14d，并在培养第7d和第14d涂片、革兰染色镜检[2]；
  2. 血琼脂平皿置（36±1）℃培养48h，观察有无细菌生长[2]；
  3. 大豆蛋白胨肉汤培养基置25~28℃培养至少14d，观察有无真菌生长[2]。

其他培养基需要在查找文献，一般置37℃培养至少48h，无菌斑形成才认为合格。

七、检测的局限性

  • 培养只涉及了细菌项目，不监测寄生虫和病毒。
  • 细菌项目仅限需氧菌，不涉及厌氧菌。
  • 细菌项目仅限在R2A琼脂培养基上可以生长的。严格意义上，至少需要SOYA、BHI、M17等多种培养基上无菌才更全面。

八、 讨论

ATP Bioluminescence Test仪器也可以用于无菌检测 ，但是需要建立自己的方法 [6]。

九. 参考文献

  1. ↑ GB 14925-2023 实验动物 环境及设施，发布日期2023-11-27，实施日期2024-06-01
  2. ↑ 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 GB/T 14926.41-2001 实验动物 无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法，P69
  3. ↑ Chriss J. Vowles • Natalie E. Anderson Kathryn A. Eaton，Gnotobiotic mouse Technology，CRC press
  4. ↑ Anderson A. W. and Elliker P. R. (1953) J. Dairy Science 36.161-167.
  5. ↑ Reiter B. and Oram J. D. (1962) J. Dairy Res.29.63-77.
  6. ↑ Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition，P73

十. 版权说明

此文章由中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心吕安老师编制，常在修改后发表。 适用于LabAnimalWiki:隐私政策。

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