安乐死

1. 目的

处死动物是对动物福利的最终剥夺，对必须处死的动物应实施安死术。IACUC所制定的安乐死操作指南为实验动物管理者、动物实验操作者及相关人员提供依据。对批准实施安乐死的动物必须由训练有素、熟练掌握人员执行。

2. 适用范围

本操作规程适用于清华大学实验动物设施内所有动物的安乐死。

3. 安乐死

当实验动物处于以下情形时应执行安乐死，

a) 动物已经濒临死亡或者不能活动，或者给予温柔刺激后都没有反应；

b) 呼吸困难：典型的症状是口鼻流涎和（或）发绀；

c) 腹泻或小便失禁；

d) 体重减少了实验前体重的 20%；

e) 无力摄食或饮水；

f) 动物出现明显焦虑、烦躁不安或肿瘤重量超过了动物自身体重的10%，相当于25 g小鼠的皮下肿瘤最大直径不能超过20 mm，250 g大鼠不能超过25 mm及肿瘤发生破溃的情况都应安乐死实验动物；

g) 瘫痪、持续性癫痫或刻板行为等；

h) 动物皮肤损伤面积占全省30%以上，或出现感染化脓的情况；

i) 其他经兽医判定需要人道终点的情况；

j) 动物实验结束或动物繁育计划需要淘汰的动物。

3.1. 安乐死操作人员的训练

动物能否安详地死亡，操作人员也是关键的因素之一。

IACUC和AV应建立定期的操作人员培训计划，内容包括安乐死的目的、各种安乐死技术、动物抓取方法、评估及舒缓动物疼痛或恐惧的方法、死亡的确认等。必要时可以安排相互的讨论与心理辅导，以疏解操作人员可能的心理压力。

3.2. 安乐死地点

实施安乐死的动物因为窘迫的叫声、恐惧的行为等皆可引起其他动物的焦虑不安，从而会影响存活动物的身心平衡与福祉，干扰实验结果。因此。动物安乐死地点最好选择远离存活动物的非公共场所。

3.3. 安乐死设备

执行安乐死所用的药剂与器具，都由专人维护，随时保持最佳使用状态。依据动物品种、体重及数量，须先备好足量的药剂及器具。动物安乐死时被血液、粪尿、毛发等沾染的器具应及时消毒清洗干净，以免引起其他安乐死动物的焦虑。

3.4. 辅助安乐死方法

在动物安乐死前，首先要考虑解除动物的疼痛与窘迫，因此面对有神经质或难以驾驭的动物，先给予镇静剂或镇痛剂等药物，以减少动物的紧迫与恐惧，随后再执行安乐死。

3.5. 动物死亡确认

实施安乐死的人员需检查动物的心跳是否完全停止、瞳孔是否放大。停止呼吸的单一现象不能作为判断动物是否死亡的依据，因为动物往往先停止呼吸，数分钟后才停止心跳，在使用CO2进行安乐死时尤其明显。

3.6. 动物尸体处理

安乐死的动物使用专用的动物自封袋包装后贮存到-20 ℃冰柜中集中冷冻存放，由专业公司统一进行焚烧做无害化处理。 取材后的动物尸体应进行缝合，确保动物尸体尽量完整。

4. 安乐死的药剂及方法

选择动物安乐死的方法，取决于动物品种、大小、温顺度、对疼痛与窘迫的感受、保定方法、实验最终的组织采样方法等。适当的保定方法不仅可以降低动物的恐惧、焦虑及疼痛，并可保障操作人员的安全。

动物死亡的机制为：

（1）直接或间接的缺氧；

（2）直接使脑神经失去机能；

（3）物理性崩解脑组织活动并破坏脑神经。

4.1. 吸入性药剂

常用药剂如氟烷（halothane）、异氟烷（isoflurane）、安氟醚（enflurane）、七氟烷（sevoflurane）、乙醚等。多数吸入性药剂对人体有害，如乙醚具有易爆炸性、氟烷易伤害肝脏、氮气和CO容易导致人体缺氧，NO容易导致人成瘾等，因此必须在通风良好的场所执行。

因乙醚具有易燃易爆的性质，现已不建议使用。如研究人员选择使用乙醚进行动物的麻醉或安乐死，必须提出合理的科学需求及依据，IACUC进行评估，仅能在具备科学研究的必要性且确认没有其他替代方案时，再经IACUC核准后实施。操作过程需全程在通风橱内进行，操作后也必须将动物尸体放置于防爆冰柜内。

4.2. 二氧化碳（CO2）

空气中含有0.04%的CO2，比重较空气重，无色，无味。当吸入浓度大于7.5%，动物的疼痛阈值上升，愈高的浓度有愈快的麻醉效果，但也有研究显示动物快速暴露于高浓度CO2时部分动物会有窘迫表现。啮齿类动物在其原来饲养笼内吸入CO2安乐死时较少出现紧迫或焦虑。

• 优点：

快速镇静、止痛、麻醉效果明确，操作简便，经济成本低。另外对啮齿类动物，不会改变其胆碱能（cholinergic marker）或皮质脂酮（corticosterone）等生理指标。

• 缺点：

由于CO2比空气重，容器内未灌满时动物往往将头部抬高而难以迅速麻醉至死亡。新生啮齿类和水生动物对CO2耐受性非常高，两栖类和爬行类动物的呼吸频率低，往往无法吸入足量的CO2，需要非常长时间才能安乐死动物。以低于80%浓度诱导动物失去知觉时，可能产生呼吸道病灶，但是高浓度可能对部分动物造成窘迫。

• 建议：

高压气瓶装CO2为唯一建议使用的设备，不推荐使用干冰或其他化学方式制造的CO2。动物在安乐死容器内不得过度拥挤，不得混入不同品种、品系的动物。

当动物呈现死亡状态后再持续灌注气体至少数分钟。将动物从安乐死容器取出前务必对动物的死亡进行最终确认，如动物未死亡，则立刻使用其他方法（如啮齿类使用脱臼）完成安乐死，使动物迅速失去意识。

4.3. 非吸入性药剂

多数为注射性药剂，能使动物迅速死亡，是非常可靠的动物安乐死方法。但须注意操作中要避免使动物遭受紧迫与恐惧，对操作人员要培训保定、注射等相关技术。注射药剂有多种给药方法，以静脉注射为最佳选择。药物注射前操作人员必须评估动物是否过度神经质或难以驾驭保定，必要时先给予镇静剂或止痛剂等药物，以便降低动物的紧迫或恐惧，并保障操作人员安全。如动物已进入垂死、休克或深度麻醉中，难以顺利进行静脉注射时，可采取心脏注射。若腹腔注射需使用较高剂量的药物。而且可能使动物延长死亡时间及死前挣扎，因此腹腔注射后，将动物移入小箱子或笼子内，置于安静无干扰的场所，以减轻兴奋程度或创伤的可能性。

4.3.1. 巴比妥盐及其衍生物（Barbiturates）

为动物安乐死的首选药物，抑制中枢神经反应，使动物失去知觉进入麻醉状态，过量的药剂使动物停止呼吸，接着心跳停止。该类药物如静脉注射，可以作为动物安乐死药剂，其中戊巴比妥钠（Pentobarbital Sodium）为最理想的动物安乐死药剂。

• 优点：

效果迅速为最主要的优点，其效果依剂量、浓度、给药方式而有差异。此药剂平稳地诱导并麻醉动物，也使动物的不适反应降到最低程度。

• 缺点：

为达到最佳效果，需给予静脉注射，因此操作人员须具备不同种动物的静脉注射给药技术。此药亦可能造成滥用，因此须按照毒麻药品管制使用。

• 建议：

对犬、猫、兔、啮齿类小型动物，须静脉注射给药，当静脉注射对动物造成紧迫或危险时采用腹腔注射，心脏注射仅适用于深度麻醉或失去意识的动物。

4.3.2. 水合氯醛（chloral hydrate）

缓慢抑制大脑，逐步压迫呼吸中枢导致缺氧而使动物死亡，操作过程中可能会使动物喘息、肌肉痉挛、吠叫。 建议：有条件性的使用于大型动物安乐死，动物须先使用药物镇定后再静脉注射该药剂，由于副作用大，不建议使用于猫狗及其他小型哺乳动物。

4.4. 物理性方法

包括颈椎脱臼、断头、放血、电击等。在良好的技巧与适当的工具配合下，能够迅速使动物解除疼痛并死亡。但有些人抗拒并排斥此类方法。没有受过良好训练和经验的操作人员，若操作不当可能造成人员受伤，更可能使动物未完全死亡而导致极大的痛苦。有些物理方法如放血、电击、脑脊髓穿刺等，不建议作为动物安乐死的单一方法，应配合其他方法而共同使用。

4.4.1. 颈椎脱臼法

常用于啮齿类动物、仔兔及禽类。通过正确的训练技巧，操作人员可迅速将动物的颈椎与脊椎脱离，使动物死亡。对于小型啮齿类动物，利用拇指、食指压住头颈部，用另一只手抓住尾巴或后肢，迅速用力向后拉扯后驱，使颈椎脱离头颅。对于仔兔，一手抓头，另一手抓后肢，将身体迅速拉长，使颈椎脱离头颅。对于禽类，双手抓取脖子扭断。

• 优点：

能使动物快速失去意识，无化学药剂污染身体组织，迅速执行完毕；

• 缺点：

可能造成执行者的不愉快感，如操作技术不佳，恐无法使动物迅速死亡，而导致动物的极大痛苦。

• 建议：

适合于禽类、小鸟、小鼠、体重200 g以下大鼠、体重低于1 kg的兔子，且由技术熟练的人员完成，执行前先给予镇定或麻醉，以减轻动物的窘迫。如需对体重较大的动物、或者未经镇定或麻醉直接采取颈椎脱臼安乐死时，则需由IACUC评估，仅能在具备科学研究的必要性并确认无其他替代方案时，再经IACUC审核通过后实施。

4.4.2. 断头

此方法用来执行小型啮齿类动物或仔兔的安乐死。采用此法可以提供研究人员无化学药剂污染的干净组织及体液，亦可提供完整的脑部组织供研究使用。断头后动物虽然呈现13-14秒的脑部活性，但是研究显示此时已无疼痛反应的传递，动物迅速失去意识。有商品化的断头台（Guillotine）可提供大鼠与仔兔的断头。

• 优点：

能使动物快速失去意识，无化学药剂污染身体组织。

• 缺点：

抓取及保定动物至断头台前可能导致动物紧迫，动物断头后存留的脑部活性尚无法确定，实施此法易造成人员的不适，亦有危险性，因此需对操作人员进行全面的培训。

• 建议：

使用本方法进行动物安乐死时，须具备科学研究的必要性，并经机构的IACUC审查后执行。需注意随时保持断头刀刃的锋利，并在每次使用后彻底清洗残留的血渍和气味。

4.4.3. 放血

已经失去意识或击昏后的动物，再配合放血方法，可确保动物的死亡。由于大量失血时动物会呈现焦虑，因此放血不得作为安乐死的单一方法。如因研究所需采取动物血液，则必须先击昏或麻醉动物后执行，并避免不完整放血，以免动物苏醒。