小鼠附睾尾低温冷藏运输标准操作规程
小鼠附睾尾低温冷藏运输的由来
近几年，基因修饰小鼠的跨省交换不断增加，简便安全，低成本的运输方式尤为重要。
现在小鼠品系运输有活体运输，冻存遗传物质运输和组织细胞冷藏运输，其中活体运输和冻存遗传物质是普遍选择的方式。
2012年，我们做过快递公司4°C冷链运输附睾尾并成功获得活体小鼠的实验。
最近有2批成功案例分享给大家，我们整理成了标准操作规程（SOP），希望可以为师生降低费用，增加效率。
为了确定附睾尾冷藏运输体系的实际操作问题，提高效率获得更多活体后代，本中心对冷藏运输体系的包装运输，冷藏精子体外受精（IVF）和胚胎移植进行标准化，以提高冷藏运输体系的效率，减少小鼠使用量，践行3R（替代Replacement、减少Reduction、优化Refinement）。
1. 目的
为了避免活体小鼠长途运输价格昂贵，并携带传染病以及运输途中动物逃跑或死亡的风险，而使用附睾冷藏运输相对简单且有效避免以上风险。
2. 适用范围
雄鼠处于性成熟期，年龄不得低于8-10周龄（12-18周龄最佳）。取附睾后，运输时间在3天时间内（附睾精子在低温下保持受精能力可达72h）。
3. 实验内容
3.1. 实验准备
3.1.1 试剂准备
1.5ml EP管若干，手术器械（眼科剪，眼科镊，消毒液等），温度数据记录仪，4度保温相关材料，矿物油。
关于矿物油，之前使用的是Sigma：M8410，https://www.sigmaaldrich.com/HK/en/product/sigma/m4810。在产品说明书上也写明是“technique(s):cell culture | embryo: suitable”（现在已经没有了，可能被投诉多了）。
还是建议修改成Sigma：M5310 https://www.sigmaaldrich.com/HK/en/product/sigma/m5310。因为M5310产品在产品说明书上写明是“technique(s):cell culture | embryo: suitable”
注意：
Sigma/Merck的矿物油产品虽然在产品说明书上写明是“technique(s):cell culture | embryo: suitable”，但是也应该做胚胎培养测试。之前常有同行们反馈被矿物油祸害过。
3.1.2 小鼠要求
每个品系最好收集2只雄鼠的附睾，以免运输单只雄鼠附睾，精子质量不好。
3.2. 附睾准备运输步骤
每个品系2只雄鼠（一般可以请所在单位的动物中心协助完成）：
- a) 准备4个含矿物油（常温）EP管，1ml/EP管，用于放置保存附睾。
- b) 取附睾，放入含矿物油的EP管中清洗一次，附睾保存在第二个EP管内。
- c) 包装附睾相关包温材料在使用前应冷却并保持4-8℃
- d) 将存有附睾的EP管放在4℃冰箱，联系顺丰快递，放在冰盒内运输。最多存放3天。
3.3. 附睾低温运输
到达本中心的冷藏精子复苏（建议以下全部在动物中心完成）：
- a) 准备获能液TYH滴，受精液HTF+GSH滴（现配现用，GSH浓度是浓度是0.307mg/ml）。100 ul/滴 ，矿物油覆盖，37℃。
- b) 从冰箱中取出存有附睾的EP管，显微镜下从附睾内取出精子到获能滴TYH。
- c) 精子获能0.5-1h后，取3-5ul（精子质量差可以增加量）加入至100ul HTF+GSH受精滴内与雌鼠卵子受精。
- d) 受精4-6h后，洗涤受精卵3次，放在HTF滴（80ul/滴）内培养过夜
- e) 收集2-cell胚胎进行胚胎移植。
4. 参考文献
- 清华大学实验动物中心SOP及网站。本网站已经获得使用许可，转载。其他网站使用，请联系用户:Changzai