H-2001-小鼠生物净化（体内+胚胎移植）标准操作规程
- 文件名：H-2001-小鼠生物净化（体内+胚胎移植）标准操作规程
- 文件编号与版本号：H-2001 V3
- 文件状态：受控
- 文件类型：SOP
1. 目的
为了使实验动物中心生物净化与转基因平台小鼠生物净化（体内+胚胎移植）实验更加规范，提供优质的技术服务，方便本平台其他工作人员学习，特制订本标准操作规程。
2. 适用范围
在实验动物中心开展的所有小鼠生物净化（体内+胚胎移植）实验活动。
3. 内容
3.1. 动物需求
3.1.1. 可以与B6交配取卵净化的，需要至少2只雄性基因型（Genotype）正确的小鼠（简称阳性小鼠），年龄范围7周到6个月，最好可以提供3只雄性阳性小鼠。此雄性阳性小鼠只是用来交配1-3次即可，不会被安乐死。
3.1.2. 不可以与B6交配取卵净化的，需要至少4对阳性小鼠，年龄范围8周到6个月，最好可以提供10只雄性阳性小鼠和10只雌性小鼠。此雄性阳性小鼠只是用来交配1-3次即可，不会被安乐死。
3.2. 实验材料
手术器械（剪刀，镊子，止血钳，消毒液等），捡卵管，高压灭菌后的平板纸，1 ml注射胰岛素器，35 mm培养皿，60 mm培养皿，DPBS（Sigma：D8662），M2 (Sigma：M7167)，孕马血清（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（宁波三生生物科技股份有限公司），麻醉剂阿佛丁。
3.3. 实验流程图
3.4. 具体的时间安排和操作流程
3.4.1. D1：接收需净化鼠（雄性8周以上）后单笼饲养3天。
3.4.2. D3：准备供体鼠（避开6-8周，最佳体重12-14 g，最佳周龄3-5周或者9-12周）转到需净化鼠房间。
3.4.3. D5：下午3:00注射PMSG，47小时。
3.4.4. 后注射HCG，10 IU/只。
3.4.5. D7：注射HCG后合笼交配，同时准备代孕受体鼠。
3.4.6. D8：检栓。见栓后单放并标记，下午进繁育室准备受体鼠（8周以上）与结扎雄鼠合笼交配。
3.4.7. D9：进繁育室检栓将见栓受体鼠拿到胚胎移植室，不要打开笼盖。同时让饲养员将见栓1.5天的供体鼠转移到屏障设施外实验室，在生物安全柜内收集输卵管。先收集当天净化品系的2细胞胚胎，再麻醉，受体鼠麻醉后皮下注射镇痛剂美洛昔康，将2细胞移植到见栓0.5天受体输卵管。操作完后观察鼠是否呼吸正常并且在笼盒内放三折纸盖好笼盖移至代孕受体繁育室饲养。
3.4.8. D14：饲养观察并观察受体是否已孕。
3.4.9. D20：前后三天，不要移动笼盒，以免雌鼠受到惊吓发生食仔。
3.4.10. D30~D32：剪尾，通知小鼠所有人有时间来平台取鼠尾做检测。
3.5. 胚胎移植实验流程
3.5.1. 注射激素（PMSG、HCG）、交配、检栓（此操作在雌雄鼠合笼的房间进行）。
3.5.2. 取雌鼠的输卵管：（此操作在屏障设施外实验室的生物安全柜内进行）。
3.5.3. 打开生物安全柜，将雌鼠安乐死，整齐摆放于三折纸上
3.5.4. 将小鼠背部朝上，并用酒精喷洒背部，这样可以减少毛发的污染。
3.5.5. 从小鼠背部两侧用眼科镊夹住皮肤，眼科剪剪开一个小口，此时可以看见皮下的脂肪，然后用眼科镊将脂肪上拉，即可看到小鼠的卵巢、输卵管及子宫。
3.5.6. 取小鼠的输卵管和子宫的一小段（图2），放于装好DPBS的EP管中，用DPBS溶液清洗2遍。
3.5.7. 在EP管上写明小鼠品系名称和拥有者。
3.5.8. 将装有输卵管的EP管放入传递窗内，并用消毒液喷洒表面。
3.5.9. 冲输卵管（图3），收集2-cell（此操作均在屏障设施内实验室的超净台内完成）。
- a) 实验人员取出传递窗中的EP管，小心拿到实验室，放入35 mm培养皿中，并用准备好的DPBS液体清洗2遍。
- b) 在显微镜下，注意仔细在盘绕的输卵管中找到伞部。用显微镊将输卵管的末端缓慢套上冲卵针头，轻轻地将冲卵针的针头压在培养皿的底部，然后用大约0.1 mL的DPBS培养液冲洗输卵管。
- c) 用捡卵针收集和挑选发育正常的2细胞胚胎，并在M2体外操作液中洗涤三遍，去除杂质。
- d) 输卵管胚胎移植。
4. 注意事项
4.1. 可以提供5只雌性的阳性或者非阳性小鼠均可以加快净化的速度。
4.2. 房间设置：需要设置3个级别，由高到低分别是SPF级小鼠繁育室（供体受体）、代孕受体繁育室、胚胎采集室。
4.3. 所有的实验用耗材，手术器械，培养箱等定期高压灭菌，灭菌有效期为1周。超过一周，需重新高压灭菌再使用。
4.4. 实验所用试剂必须正确使用与保存。
4.5. 移植操作时必需在超净台内完成。
4.6. 与实验无关人员禁止进入实验室。
5. 参考文献
- 清华大学实验动物中心SOP及网站。本网站已经获得使用许可，转载。其他网站使用，请联系用户:Changzai