H-2002-小鼠生物净化（新鲜精子IVF+胚胎移植）标准操作规程

文件名：H-2002-小鼠生物净化（新鲜精子IVF+胚胎移植）标准操作规程
文件编号与版本号：H-2002 V3
文件状态：受控
文件类型：SOP

1. 目的

为了使实验动物中心生物净化与转基因平台小鼠生物净化（新鲜精子IVF+胚胎移植）实验更加规范，提供优质的技术服务，方便本平台工作人员学习，特制订本标准操作规程。

2. 适用范围

在实验动物中心进行的小鼠生物净化（新鲜精子IVF+胚胎移植）实验。

3. 内容

3.1. 动物需求（B6背景的品系）

3-5周或9-12周的雌鼠；10周以上，最佳12-18周的雄鼠。

3.2. 实验材料

手术器械（剪刀，镊子，止血钳，消毒液等），捡卵管，高压灭菌后的平板纸， 35 mm培养皿， M2 (Sigma：M7167)，孕马血清（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，简称PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，简称HCG，宁波三生生物科技股份有限公司），麻醉剂三溴乙醇。

3.3. 实验流程图

3.4. IVF（B6背景的品系）标准操作流程

3.4.1. Day1，在下午4:00 -7:00 之间对3-5周或9-12周的雌鼠注射PMSG，10 IU/只。

3.4.2. Day3，在注射PMSG 47小时后，给小鼠注射同样量的HCG，10 IU/只。根据早上卵子收集的时间（为了得到质量佳的卵子尽可能的在注射HCG 16-18小时收集）。

3.4.3. Day 4，体外受精（IVF）：新鲜精子的IVF

a) 所需要的培养滴：获能滴TYH 100 μL/滴，受精滴HTF 200 μL/滴（高滴操作）；准备采集附睾和输卵管的培养皿（装有500 μl矿物油）；洗卵滴（培养滴）HTF 60 μL /滴；最后矿物油覆盖，37 ℃培养箱预热，半小时以上。

图2. 培养滴

图示a是TYH培养滴，b是HTF培养滴，c是洗滴培养滴

b) 安乐死雄鼠，取附睾尾收集精子；雄鼠腹部朝上，两个大腿根部中间眼科剪剪开皮和肌肉层，暴露出睾丸附睾，取附睾尾。

c) 手术纸上，去除附睾上残留的脂肪和血。

d) 显微镜下，获能皿油内采集鲜精：显微剪在附睾尾前端显微剪横切面剪开附睾尾，成熟精子成液滴，显微镊拉入获能滴内获能。

e) 培养箱内孵育上游1小时左右，精子计数，1 - 25 x 106 精子/mL（经验熟练者，通过眼睛目测判断精子质量，选择获能滴外围游动快的精子）。

f) 根据获能时间和采集卵子时间，安乐死雌鼠，HCG16-18小时后，取输卵管收集卵子。

g) 手术纸上，去除输卵管上残留的的脂肪和血。

h) 受精皿油内采集卵子，显微镊撕破输卵管膨大部，带有卵丘细胞的卵子游离出来，拉入受精滴内。

i) 获能后的精子加入受精滴内，3-5 μL /滴。

j) 受精4-6小时后，捡卵，洗涤死精和颗粒细胞。将正常形态的卵细胞转移到洗涤培养皿内，洗涤2遍。

k) 过夜培养，收集2细胞胚胎。

3.4.4. Day 5：胚胎移植，转移胚胎（2细胞胚胎）到假孕受体内或在M16培养液内培养，根据实验要求进行实验。

a) 计算有多少枚胚胎需要移植，需要多少只受体。

b) 取受体雌鼠，称重并用阿佛丁麻醉（0.12-0.15 mL/10 g）进行麻醉。

c) 待雌鼠麻醉后用眼科弯剪或者推子去掉背部毛发，然后75 %酒精棉球消毒。

d) 受体背部开口，左手持组织镊夹起表皮，右手用眼科在受体背部剪开一个竖向切口。

e) 用组织镊伸到背部表皮左侧，找准输卵管位置，组织镊撕开一个小口，找到输卵管。

f) 用镊子夹住卵巢脂肪，轻轻拉出，用动脉夹夹住卵巢脂肪，逆时针旋转，将膨大部置于表面。

g) 在体式镜下观察是否有膨大部，然后用显微镊夹起一小块滤纸片摆正膨大部位置，方便移植。

h) 拿出含有需要移植的胚胎的培养皿，用捡卵管转移2细胞期胚胎（立体亮圆），在M2液滴里洗三遍，去除矿物油。

i) 用移植针先做两个气柱，再吸取2细胞期胚胎，将捡卵管放置在体式镜上方，便于拿取。

j) 左手持显微镊夹住膨大部第一个拐弯的上游，右手用1 mL注射器打孔。

k) 将移植针从刚才打孔位置伸入至膨大部上方，确保进去后，吹出胚胎，如果看见有1到2个气泡进入膨大部即为移植成功。

l) 缝合本侧肌肉层，按照同样步骤移植另外一侧，最后缝合表皮，并用75 %酒精棉球消毒。

m) 将移植后的小鼠两只一笼放入新笼，标注品系名称、移植受精卵数量、移植人，移植日期。

4. 注意事项

IVF即在体外环境下，获能的精子和成熟的卵子相混合，完成受精的过程。IVF中注意事项如下，

4.1. 透明带硬化

随着时间的变化，精子越来越难进入透明带。卵子在体外时间越长，透明带会变得越硬化。收集卵子时切记要快。

4.2. 温度至关重要

尽可能任何东西都保持在37 ℃。在显微镜旁边设立一个小的培养箱，尽量使受精皿少暴露在室温和大气中。

4.3. 时间很重要

精子获能时间一般30 min-50 min，决定了精子活力。一般情况下，冷冻精子和精子差小鼠品系，获能时间30 min。精卵孵育时间是4-6 h，不是孵育时间越久越好。

4.4. PH值也很重要

在空气中，培养液的PH值会很快升高。尽量保持受精滴在培养箱内。

4.5. 空气环境尽可能接近屏障环境指标

实验室内挥发性的有机化合物很大程度影响IVF的成功和移植后胚胎的发育能力，实验室环境应维持在最佳空气状态下。

5. 技术要点

5.1. 促性腺激素

每批次激素效果也存在不同，请选择来源稳定的供应商。除了激素本身，影响小鼠激素超排的因素较多，主要有腹腔注射，实验小鼠品系，周龄和营养状态，激素注射剂量等。

激素超排，请选择小鼠的右腹进行腹腔注射。杂交系小鼠品系激素超排要好于近交系和封闭群，Balb/c小鼠激素超排很不稳定，一般选择4周龄或者8周龄。其他小鼠品系选择最佳周龄3-5周或者9-12周，避开6-8周的激素不敏感期。不同实验室在注射剂量上存在较多差异，多选择5-10 IU/只不等，平台选择10 IU/只。注射过一次激素的雌鼠，需要等2周后可以安排激素处理。

5.2. 实验体系

新鲜精子采用TYH 100 μL，HTF100+100 μL（高滴），洗涤培养皿根据胚胎数量而定，1 μL /1枚胚胎。

冷冻精子采用TYH 90 μL，HTF45+45 μL（高滴）添加GSH（现配现用，称量0.0307 g谷胱甘肽放到EP管内，用1 mL HTF溶解，过滤。取过滤后试剂10 μL加入1 mL HTF试剂中，混匀后做受精滴，以此类推。这种受精滴用于冻精复苏或者精子不好品系），洗涤培养皿根据胚胎数量而定，1 μL /枚胚胎。

精子差的品系采用TYH 60 μL，HTF100+100 μL（高滴）添加GSH，1 μL /枚胚胎。

5.3. 胚胎移植

操作简单但是是实验体系中关键的步骤。ICR受体使用体重30-40 g左右，见栓0.5天受体膨大部明显，没有膨大部的受体不能使用，该受体可以移植原核期到囊胚期的任何阶段的胚胎。见栓2.5天受体可以移植囊胚期胚胎。

不同方式来源的胚胎假孕受体移植数量不同，体内胚胎双侧20枚左右，单侧15枚左右。体外操作的胚胎建议采用双侧移植30枚左右。

5.4. 矿物油

矿物油是小鼠胚胎操作技术实验中容易忽略的一部分。每批次矿物油必须进行胚胎培养验证，严格避光保存，不能照射紫外。实验过程中不能随意带入下一步的操作中。

以上文件版权和解释权归清华大学实验动物中心所有。

附录

1. 试剂配方

1.1. TYH配方

1.2. HTF配方

注：试剂配制都需要添加双抗和酚红。

2. 鼠体外受精（IVF）技术质量图鉴

旨在通过小鼠精子质量及排卵数量，合理估算小鼠鲜精IVF后2细胞发育率，从而安排下一步实验。

2.1. 精子质量

2.1.1. 附睾尾形态

推荐选用12-18周最佳周龄的健康雄鼠。附睾尾应左右两侧大小均匀、饱满,镜下观察精子充满曲精管，无透明状态。若雄鼠周龄偏小，则附睾尾偏小，镜下呈现透明状，内里无精子。如图1所示。

此外，健康状态差或年龄较大的雄鼠会出现无精、死精（镜下观察精子无自由溢出），附睾尾不饱满，左右侧差异较大等情况。如图2所示。

2.1.2. 精子扩散

除了依据附睾状态外，我们还可以根据镜下精子扩散情况，进一步判断精子质量的优劣。如图3所示。

3. 排卵

推荐选用3-5周或9-12周雌鼠，在注射HCG 16-18小时后收集卵子。适龄雌鼠（除特殊品系，例DBA等外）超排后小鼠镜下壶腹部膨大明显。排卵佳。对激素作用不敏感期的小鼠超排后镜下壶腹部无膨大，排卵差。如图4所示。

4. 洗胚

精子和卵子混合4-6小时后，洗胚时去除非正常形态卵细胞，如图5所示保留正常受精后。

5. 参考文献

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