H-2003-小鼠生物净化（冷藏精子IVF+胚胎移植）标准操作规程

1. 目的

为了使实验动物中心生物净化和转基因平台冷藏精子体外受精（In vitro fertilization，IVF）实验更加规范，提供优质的技术服务，方便本平台工作人员学习，特制订本标准操作规程。

该方法可用于挽救短暂时间死亡基因修饰小鼠品系，及附睾冷链运输后的精子采集及IVF。此标准操作规程主要适用于B6背景的小鼠品系，其他背景品系小鼠，需要适当调整。

在下午4:00 -7:00 之间对3-5周或9-12周的雌鼠注射孕马血清（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG），10 IU/只。

在注射PMSG 47小时后，注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），10 IU/只。根据早上卵子收集的时间（为了得到质量佳的卵子尽可能的在注射HCG 16-18小时收集）。

雄鼠附睾采集：实验小鼠（一般需要运输的动物）取出附睾尾放置盛有矿物油的EP管内，标记清楚品系名称等信息，4 ℃保存或者运输。

体外受精（IVF）：冷藏精子的IVF

3.3.1. 实验准备：35 mm培养皿，1.5 mL EP管若干，获能液TYH，受精液HTF，谷胱甘肽（GSH），M2，矿物油，电子天平等。

3.3.2. 所需要的培养滴：获能滴TYH 100 μL/滴;受精滴HTF 200 μL滴（高滴操作）；准备采集输卵管的培养皿（装有500 μL矿物油）；洗卵滴（培养滴）HTF 60 μL /滴；最后矿物油覆盖，37 ℃培养箱预热半小时以上。

3.3.3. 从4 ℃取出盛有附睾尾的EP管，取出附睾尾。

3.3.4. 手术纸上去除附睾上残留矿物油和脂肪等。

3.3.5. 采集精子，显微剪在附睾尾前端横切面剪开附睾尾，采集精子拉入获能滴内，培养箱内上游40分钟左右（精子计数，1~25 x 106 精子/mL，经验熟练者，通过眼睛目测判断精子质量，选择获能滴外围游动快的精子）。

3.3.6. 安乐死雌鼠（3-5周或9-12周），HCG16-18小时后，取输卵管收集卵子。

3.3.7. 手术纸上去除输卵管上残留的的脂肪和血。

3.3.8. 受精皿矿物油内采集卵子，使用显微镊撕破输卵管膨大部，带有卵丘细胞的卵子游离出来，拉入受精滴内。

3.3.9. 上游好的精子加入受精滴内，3-5 μL /滴。

3.3.10. 受精4-6小时后，捡卵，洗涤死精和颗粒细胞。

3.3.11. 过夜培养，收集2细胞胚胎。

2细胞胚胎移植（输卵管壁移植），转移胚胎（2细胞）到代孕受体内或在KSOM /M16培养液内培养。

3.4.1. 计算有多少枚胚胎需要移植，需要多少只受体。

3.4.2. 取受体雌鼠，称重并用阿佛丁（0.12-0.15 mL/10 g）进行麻醉。

3.4.3. 待雌鼠麻醉后用眼科弯剪或者推子去掉背部毛发，然后75 %酒精棉球消毒。

3.4.4. 受体背部开口，左手持组织镊夹起表皮，右手用眼科在受体背部剪开一个竖向切口。

3.4.5. 用组织镊伸到背部表皮左侧，找准输卵管位置，组织镊撕开一个小口，找到输卵管。

3.4.6. 用镊子夹住卵巢脂肪，轻轻拉出，用动脉夹夹住卵巢脂肪，逆时针旋转，将膨大部置于表面。

3.4.7. 在体式镜下观察是否有膨大部，然后用显微镊夹起一小块滤纸片摆正膨大部位置，方便移植。

3.4.8. 拿出含有需要移植的胚胎的培养皿，用捡卵管转移2细胞期胚胎（立体亮圆），在M2液滴里洗三遍，去除矿物油。

3.4.9. 用移植针先做两个气柱，再吸取2细胞期胚胎，将捡卵管放置在体式镜上方，便于拿取。

3.4.10. 左手持显微镊夹住膨大部第一个拐弯的上游，右手用1 mL注射器打孔。

3.4.11. 将移植针从刚才打孔位置伸入至膨大部上方，确保进去后，吹出胚胎，如果看见有1到2个气泡进入膨大部即为移植成功。

3.4.12. 缝合本侧肌肉层，按照同样步骤移植另外一侧，最后缝合表皮，并用75 %酒精棉球消毒。

3.4.13. 将移植后的小鼠两只一笼放入新笼，标注品系名称、移植受精卵数量、移植人，移植日期。

4.1. 短时间内组织内的细胞还没有完全丧失活力，可以在限定时间内收集组织安排相应的挽救措施。

4.2. 雄鼠的精子对温度很敏感，短时间内附睾放置低温下可以保护精子的活力。

4.3. 突然死亡的雄鼠，24小时内取出附睾放置盛有矿物油的EP管内，参考利用IVF挽救繁育困难或死亡小鼠标准操作流程。