H-2004-利用IVF挽救繁育困难或死亡小鼠标准操作规程

• 文件名：H-2004-利用IVF挽救繁育困难或死亡小鼠标准操作规程
• 文件编号与版本号：H-2004 V2
• 文件状态：受控
• 文件类型：SOP

1. 目的

挽救繁育困难的小鼠品系，或短时间内死亡的珍贵小鼠品系。

2. 使用范围

适用于年老丧失生殖能力的雄鼠、死亡时间在24小时内的雄鼠以及处于性成熟期但自然繁育困难的小鼠品系获得后代所进行的小鼠体外受精（IVF）活动。

3. 实验流程

3.1. 实验准备

35 mm培养皿，1.5 mL EP管若干，手术器械（剪刀，镊子，止血钳，消毒液等），孕马血清（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，简称PMSG），人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，简称HCG），谷胱甘肽（简称GSH），M2（Sigma：M7167），矿物油（Sigma：M8410），麻醉剂阿佛丁。

3.2. 挽救自然繁育困难的小鼠品系

3.2.1. 超排雌鼠，16:30 注射PMSG 10 IU/只，47小时后注射HCG 10.0 IU /只。

3.2.2. 注射HCG 16小时后，准备获能液TYH 60 μL /滴，受精液HTF 200 μL /滴。洗涤滴（培养滴）HTF 60 μL /滴4个，矿物油覆盖，37 ℃培养箱预热至少20分钟。

3.2.3. 安乐死雄鼠，取附睾，显微镜下从附睾内取出精子至获能滴TYH中，置于37 ℃培养箱内。

3.2.4. 安乐死雌鼠，取输卵管放置矿物油内，取出卵子至HTF受精滴内，置于37 ℃培养箱内。

3.2.5. 精子获能1小时后，取2-3 μL（根据精子活力和密度判断）至HTF受精滴内与卵子混合。

3.2.6. 受精4-6小时后，将受精卵于HTF（培养滴）内洗涤3次，培养过夜。

3.2.7. 次日晨收集2细胞期胚胎进行胚胎移植。

3.3. 挽救突然死亡雄鼠品系

3.3.1. 准备2个EP管，每管装入1 mL矿物油，用于放置保存附睾。

3.3.2. 取雄鼠附睾，放入含常温矿物油的EP管中清洗一次，转移并保存于装有矿物油的EP管内，置于冰箱4 ℃保存。

3.3.3. 当天超排雌鼠，16:30 注射PMSG 10.0 IU /只，47小时后注射HCG 10.0 IU /只。

3.3.4. 注射HCG 16小时后，准备获能液TYH 60 μL /滴，受精液HTF+GSH滴（现配现用）100 μL /滴。 洗卵滴（培养滴）HTF 60 μL /滴4个，矿物油覆盖，37 ℃培养箱预热至少20分钟。

3.3.5. 取出存有附睾的EP管，显微镜下从附睾内取出精子至获能滴TYH中，置于37 ℃培养箱内。

3.3.6. 安乐死雌鼠，取输卵管放置矿物油内，取出卵子至HTF受精滴内，置于37 ℃培养箱内。

3.3.7. 精子获能0.5-1小时后，取3-5 μL（根据精子活力和密度判断）至100 μL HTF+GSH受精滴内与卵子混合。

3.3.8. 受精4-6小时后，将受精卵于HTF（培养滴）内洗涤3次，培养过夜。

3.3.9. 第二天上午进行2细胞胚胎统计，并进行胚胎移植或其他实验。

4. 注意事项

4.1. 添加GSH的受精液，一定现配现用。

4.2. 注意根据雄鼠的状态和附睾尾质量，随时调整TYH培养滴大小，50-100 μL不等。

4.3. 年老丧失生殖能力雌鼠或者死亡时间在24小时内的雌鼠欲获得后代，需要参考卵巢移植标准操作流程。

5. 参考文献

• 清华大学实验动物中心SOP及网站。本网站已经获得使用许可，转载。其他网站使用，请联系用户:Changzai