H-3001-小鼠DAP213方法胚胎冻存和复苏操作规程

1. 目的

为了规范实验室小鼠胚胎冷冻和复苏操作，特制订本标准操作规程。

2-cell胚胎冷冻是将体外受精方式得到的2-cell胚胎，通过DAP213冻存方式进行冻存保种，可以长期保存珍贵小鼠品系。

复苏验证：一是为了确认冻存品系基因型的正确性，二是为了保证冻存的效率，是否考虑第二次冻存。

PB1、1 M DMSO、DAP213A、DAP213B、0.25 M Sucrose。

4.2.1. 根据要求超排雌鼠，获取胚胎冷冻品系所需的胚胎。

4.2.2. 耗材：培养皿，冻存管夹，冻存管，不锈钢保温桶，口吸管，EP管，枪头。

4.2.3. 试剂：液氮，1 M DMSO，DAP213A，DAP213B，0.25M Sucrose，M16培养液。

4.2.4. 仪器：计时器，体视镜，镊子，CO2培养箱，移液器。

4.2.5. 试剂预冷：1 M DMSO，DAP213A，DAP213B，冰上预冷30 min以上。

4.2.6. 实验过程使用的耗材冰上预冷30 min。

4.2.7. 将1 M DMSO过滤，将DAPA：DAPB=1：1配制成DAP213，现配现用，使用前混匀。

4.2.8. 冻存管品系标记（冻存管编号，胚胎数量，品系，PI，实验日期，操作者）。

4.3.1. 在培养皿上做4个100 μl DMSO的液滴，口吸管吸取150枚 2-cell至其中1个液滴，然后分别捡入其他3个液滴里，每个液滴分装50枚胚胎。

4.3.2. 用移液器吸取5 μl含有胚胎的DMSO转移至冻存管底部。冰上平衡5 min，之后加入45 μl DAP213，拧好冻存管盖（回旋半圈），冰上平衡5 min，直接放入液氮。
一次可冻存3-4管。
（注：初学者为保证质量可以一次冻存一管）。

4.3.3. 将冻存完成的胚胎转移至液氮罐，记录位置信息。

4.4.1. 取0.25 M Sucrose置于CO2培养箱预热1.5 h，在培养皿制作10-13个M16 微滴，覆盖矿物油预热30 min。

4.4.2. 查询记录找到需要冻存的胚胎，从液氮罐中转移到装有液氮的保温桶。

4.4.3. 从液氮中取出冻存管，开盖倒掉液氮，室温放置30 s，加入900 μl Sucrose，用移液器轻轻快速吹打10次左右，吸出试剂和胚胎；再吸取剩余的Sucrose加入冻存管，吸出遗漏的胚胎。

4.4.4. 将所有收集的胚胎转移到提前预热的M16微滴内，在M16微滴内清洗三遍，M16微滴37 ℃培养30 min后取见栓0.5天受体进行移植。

复苏操作中，吹打胚胎轻柔且快速，避免损伤胚胎以及出现气泡导致丢失胚胎。