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*'''文件名'''：H-3002-小鼠胚胎载杆冻存和复苏标准操作规程
*'''文件编号与版本号'''：[[H-3002]] V1
*'''文件状态'''：受控
*'''文件类型'''：SOP

== 1. 目的 ==

为了规范实验室小鼠胚胎冷冻和复苏操作，特制订本标准操作规程。

== 2. 适用范围 ==

2-细胞胚胎冷冻是将体外受精方式得到的2-细胞胚胎，通过载杆冻存方式进行冻存保种，可以长期保存珍贵小鼠品系。

复苏验证：一是为了确认冻存品系基因型的正确性，二是为了保证冻存的效率，是否考虑第二次冻存。

== 3. 实验流程图 ==

图1 实验流程图

== 4. 胚胎冻存和复苏操作规程 ==

=== 4.1. 试剂准备 ===

配制平衡液、冷冻液、解冻液。按照表1的配方配制各胚胎细胞处理液。

表1 试剂配制方法

| 处理液名称        | 胎牛血清 | HTF  | 丙二醇  | 乙二醇  | 蔗糖   |
| ------------ | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 平衡液A（10mL）   | 2    | 6.5  | 0.75 | 0.75 | --   |
| 冷冻液B（10mL）   | 2    | 3.85 | 1.5  | 1.5  | 1.98 |
| 第一解冻液C（10mL） | 2    | 6    | --   | --   | 3.42 |
| 第二解冻液D（10mL） | 2    | 7    | --   | --   | 1.71 |
| 第三解冻液E（10mL） | 2    | 8    | --   | --   | --   |
|              |      |      |      |      |      |

注：1、表中各处理液的总体积为10 mL，以上组分之和如不足10 mL，以水补齐.

=== 4.2. 载杆冻存法胚胎冻存操作规程 ===

==== 4.2.1. 实验准备 ====

:a) 根据要求超排雌鼠，获取胚胎冷冻品系所需的胚胎。

:b) 耗材：培养皿，泡沫盒，口吸管，EP管，枪头。

:c) 试剂：液氮，M16，冷冻平衡液A，冷冻液B，解冻液C，解冻液D，解冻液E。

:d) 仪器：计时器，体视镜，CO2培养箱，移液器。

:e) 制作M16培养皿：在培养皿内制备10-13滴M16液滴，每滴体积15-20 μl，并覆盖矿物油，培养箱内预热30分钟及以上。

:f) 通过体外受精获得的2-细胞胚胎用于胚胎冷冻。

:g) 平衡液, 冷冻液预先放室温（24 ℃以上）2小时。

:h) 在准备进行胚胎冷冻前将泡沫盒中装上液氮备用，液氮装至泡沫盒的7-8成，若胚胎冷冻时间较长，液氮挥发较多，则应及时添加液氮。

==== 4.2.2. 操作步骤 ====

:a) 每个皿加200 ul 平衡液A，将胚胎移至平衡液中，平衡5分钟，观察皱缩。起初收缩，后细胞又渐渐恢复原来形态。

:b) 在载杆上标注胚胎编号。

:c) 用冷冻液B做三个滴，每个滴约20 μl，将平衡好的胚胎移至B中，依次清洗（去除A），在B中时间共计1分钟。

:d) 胚胎装载杆，用口吸管吸取胚胎吹在载杆上，适当吸去多余的B液，后直接投入泡沫盒液氮中，套上帽子。装杆时间不超过30秒，在B中不超过1分30秒。冷冻结束后将同品系5根/管放入5 ml冻存管，放入液氮罐中，做好详细记录。

=== 4.3. 载杆冻存法胚胎复苏操作规程 ===

==== 4.3.1. 实验准备 ====

:a) 解冻前准备好见栓0.5天的代孕受体。

:b) 制作M16培养皿：在培养皿内制备10-13滴M16液滴，每滴体积15-20 μl，并覆盖矿物油，培养箱内预热30分钟及以上。

:c) 解C加500 μl /皿，放入37℃培养箱预热2小时及以上。

:d) 解D加500 μl /皿，解E加500 μl /皿，放室温2小时以上。

:e) 查好解冻品系位置，从液氮罐中取出载杆放入事先准备好的泡沫盒液氮中。

==== 4.3.2. 操作步骤 ====

:a) 在泡沫盒中用大镊子夹住帽子，拧开，让帽子在液氮中自由脱开，左手拿住载杆，瞬时轻甩，立即将载杆正面向上浸入解C中，停留一会，左右轻晃，至胚胎自由漂到解C中，若胚胎粘在载杆上，则用吸卵针轻推，取出载杆，观察胚胎状态，解C中静置1分钟，若胚胎恢复慢可稍微延长时间。

:b) 迅速将胚胎从解C转移至解D中，停留3-5分钟。

:c) 将胚胎从解D转移至解E中，停留10分钟。

:d) 将胚胎从解E中转移至培养皿，在M16培养皿中清洗3遍以上后放入5% CO2、37 ℃培养箱中进行微滴培养。

:e) 将复苏后形态正常的胚胎，移植入见栓0.5天代孕受体体内。

:f) 做好详细记录。

== 5. 注意事项 ==
=== 5.1. 温度控制 ===
操作时室温控制在24 ℃以上，所有使用的器材、试剂需在24 ℃以上的环境中平衡2小时。

=== 5.2. 冷冻液 ===
胚胎在冷冻液中的时间根据胚胎形态来定，这跟房间温度有很大的关系。冻存中，在B冷冻液的时间严格把控。超过时间会出现胚胎死亡现象。

== '''6. 参考文献''' ==
*清华大学实验动物中心SOP及网站。本网站已经获得使用许可，转载。其他网站使用，请联系[[用户:Changzai]]
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